zprávy

V posledním desetiletí se technologie genového sekvenování široce používá ve výzkumu rakoviny a klinické praxi a stala se důležitým nástrojem pro odhalení molekulárních charakteristik rakoviny. Pokroky v molekulární diagnostice a cílené terapii podpořily rozvoj konceptů precizní terapie nádorů a přinesly velké změny do celé oblasti diagnostiky a léčby nádorů. Genetické testování lze použít k varování před rizikem rakoviny, k vedení rozhodnutí o léčbě a k vyhodnocení prognózy a je důležitým nástrojem pro zlepšení klinických výsledků pacientů. Zde shrnujeme nedávné články publikované v CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol a dalších časopisech, které se zabývají aplikací genetického testování v diagnostice a léčbě rakoviny.

Somatické mutace a mutace zárodečné linie. Rakovina je obecně způsobena mutacemi DNA, které mohou být zděděny od rodičů (mutace zárodečné linie) nebo získané s věkem (somatické mutace). Mutace zárodečné linie jsou přítomny od narození a mutátor obvykle nese mutaci v DNA každé buňky v těle a může být přenesen na potomky. Somatické mutace jedinci získávají v negametických buňkách a obvykle se nepřenášejí na potomky. Jak zárodečné, tak somatické mutace mohou zničit normální funkční aktivitu buněk a vést k maligní transformaci buněk. Somatické mutace jsou klíčovým faktorem malignity a nejvíce prediktivním biomarkerem v onkologii; přibližně 10 až 20 procent pacientů s nádory však nese zárodečné mutace, které významně zvyšují jejich riziko rakoviny, a některé z těchto mutací jsou také terapeutické.
Řidičská a pasažérská mutace. Ne všechny varianty DNA ovlivňují funkci buněk; v průměru je k vyvolání normální buněčné degenerace zapotřebí pět až deset genomových událostí, známých jako „řídicí mutace“. Řidičské mutace se často vyskytují v genech úzce souvisejících s buněčnými životními aktivitami, jako jsou geny zapojené do regulace buněčného růstu, opravy DNA, kontroly buněčného cyklu a dalších životních procesů, a mají potenciál být použity jako terapeutické cíle. Celkový počet mutací v jakékoli rakovině je však poměrně velký, od několika tisíc u některých druhů rakoviny prsu až po více než 100 000 u některých vysoce variabilních kolorektálních a endometriálních karcinomů. Většina mutací nemá žádný nebo jen omezený biologický význam, i když se mutace vyskytuje v kódující oblasti, takové nevýznamné mutační události se nazývají „pasažérské mutace“. Pokud genová varianta v určitém typu nádoru predikuje jeho odpověď na léčbu nebo rezistenci na ní, je varianta považována za klinicky operabilní.
Onkogeny a tumor supresorové geny. Geny, které jsou u rakoviny často mutovány, lze zhruba rozdělit do dvou kategorií, onkogeny a tumor supresorové geny. V normálních buňkách hraje protein kódovaný onkogeny hlavně roli v podpoře buněčné proliferace a inhibici buněčné apoptózy, zatímco protein kódovaný onkosupresorovými geny je zodpovědný hlavně za negativní regulaci buněčného dělení a za udržení normální buněčné funkce. V procesu maligní transformace vede genomová mutace ke zvýšení aktivity onkogenů a snížení nebo ztrátě aktivity onkosupresorových genů.
Malá variace a strukturní variace. Toto jsou dva hlavní typy mutací v genomu. Malé varianty mění DNA změnou, delecí nebo přidáním malého počtu bází, včetně inzerce bází, delece, posunu čtecího rámce, ztráty start kodonu, ztráty stop kodonu atd. Strukturní variace je rozsáhlá přeskupení genomu, zahrnující genové segmenty o velikosti od několika tisíc bází až po většinu chromozomu, včetně změn počtu kopií genu, delece chromozomu, duplikace, inverze nebo translokace. Tyto mutace mohou způsobit snížení nebo zvýšení funkce proteinů. Kromě změn na úrovni jednotlivých genů jsou genomové signatury součástí klinických sekvenčních zpráv také genomové signatury. Genomové signatury lze vnímat jako komplexní vzorce malých a/nebo strukturních variací, včetně mutační zátěže nádoru (TMB), mikrosatelitní instability (MSI) a homologních rekombinačních defektů.

Klonální mutace a subklonální mutace. Klonální mutace jsou přítomny ve všech nádorových buňkách, jsou přítomny při diagnóze a zůstávají přítomny i po postupu léčby. Klonální mutace proto mají potenciál být použity jako terapeutické cíle pro nádory. Subklonální mutace jsou přítomny pouze v podskupině rakovinných buněk a mohou být detekovány na začátku diagnózy, ale s následnou recidivou mizí nebo se objevují až po léčbě. Heterogenita rakoviny označuje přítomnost více subklonálních mutací v jednom nádorovém onemocnění. Je pozoruhodné, že drtivá většina klinicky významných řídicích mutací u všech běžných druhů rakoviny jsou klonální mutace a zůstávají stabilní po celou dobu progrese rakoviny. Rezistence, která je často zprostředkována subklony, nemusí být detekována v době diagnózy, ale objeví se, když po léčbě dojde k relapsu.

Tradiční technika FISH neboli buněčný karyotyp se používá k detekci změn na chromozomální úrovni. FISH lze použít k detekci genových fúzí, delecí a amplifikací a je považována za „zlatý standard“ pro detekci takových variant s vysokou přesností a citlivostí, ale omezenou propustností. U některých hematologických malignit, zejména akutní leukémie, se karyotypizace stále používá k diagnostice a prognóze, ale tato technika je postupně nahrazována cílenými molekulárními testy, jako jsou FISH, WGS a NGS.
Změny v jednotlivých genech lze detekovat pomocí PCR, a to jak real-time PCR, tak digitální kapkovou PCR. Tyto techniky mají vysokou citlivost, jsou vhodné zejména pro detekci a monitorování malých zbytkových lézí a umožňují získat výsledky v relativně krátkém čase. Nevýhodou je omezený detekční rozsah (obvykle detekují pouze mutace v jednom nebo několika genech) a omezená je i možnost provedení více testů.
Imunohistochemie (IHC) je monitorovací nástroj založený na proteinech, který se běžně používá k detekci exprese biomarkerů, jako jsou ERBB2 (HER2) a estrogenové receptory. IHC lze také použít k detekci specifických mutovaných proteinů (jako je BRAF V600E) a specifických genových fúzí (jako jsou fúze ALK). Výhodou IHC je, že ji lze snadno integrovat do rutinního procesu analýzy tkání, takže ji lze kombinovat s dalšími testy. IHC navíc může poskytnout informace o subcelulární lokalizaci proteinů. Nevýhodami jsou omezená škálovatelnost a vysoké organizační nároky.
Sekvenování druhé generace (NGS) NGS využívá vysoce výkonné techniky paralelního sekvenování k detekci variací na úrovni DNA a/nebo RNA. Tuto techniku ​​lze použít k sekvenování jak celého genomu (WGS), tak i sledovaných genových oblastí. WGS poskytuje nejkomplexnější informace o genomových mutacích, ale jeho klinické využití je spojeno s mnoha překážkami, včetně potřeby čerstvých vzorků nádorové tkáně (WGS zatím není vhodný pro analýzu vzorků imobilizovaných formalinem) a vysokých nákladů.
Cílené NGS sekvenování zahrnuje sekvenování celých exonů a panel cílových genů. Tyto testy obohacují oblasti zájmu DNA sondami nebo PCR amplifikací, čímž omezují potřebné množství sekvenování (celý exom tvoří 1 až 2 procenta genomu a i velké panely obsahující 500 genů tvoří pouze 0,1 procenta genomu). Ačkoli sekvenování celých exonů funguje dobře ve formalínem fixovaných tkáních, jeho náklady zůstávají vysoké. Kombinace cílových genů jsou relativně ekonomické a umožňují flexibilitu při výběru testovaných genů. Kromě toho se jako nová možnost genomové analýzy pacientů s rakovinou objevuje cirkulující volná DNA (cfDNA), známá jako tekuté biopsie. Jak rakovinné buňky, tak normální buňky mohou uvolňovat DNA do krevního oběhu a DNA uvolněná z rakovinných buněk se nazývá cirkulující nádorová DNA (ctDNA), kterou lze analyzovat za účelem detekce potenciálních mutací v nádorových buňkách.
Volba testu závisí na konkrétním klinickém problému, který má být řešen. Většinu biomarkerů spojených se schválenými terapiemi lze detekovat pomocí technik FISH, IHC a PCR. Tyto metody jsou vhodné pro detekci malého množství biomarkerů, ale s rostoucí propustností nezlepšují účinnost detekce a pokud je detekováno příliš mnoho biomarkerů, nemusí být k dispozici dostatek tkáně pro detekci. U některých specifických druhů rakoviny, jako je rakovina plic, kde je obtížné získat vzorky tkáně a existuje více biomarkerů k testování, je použití NGS lepší volbou. Závěrem lze říci, že volba testu závisí na počtu biomarkerů, které mají být u každého pacienta testovány, a na počtu pacientů, u kterých má být biomarker testován. V některých případech je použití IHC/FISH dostatečné, zejména pokud byl identifikován cíl, jako je detekce estrogenových receptorů, progesteronových receptorů a ERBB2 u pacientek s rakovinou prsu. Pokud je vyžadováno komplexnější zkoumání genomových mutací a hledání potenciálních terapeutických cílů, je NGS organizovanější a nákladově efektivnější. Kromě toho lze NGS zvážit v případech, kdy jsou výsledky IHC/FISH nejednoznačné nebo neprůkazné.

Různé směrnice poskytují vodítka k tomu, kteří pacienti by měli být způsobilí k genetickému testování. V roce 2020 vydala pracovní skupina ESMO Precision Medicine první doporučení pro testování NGS u pacientů s pokročilým karcinomem, v nichž doporučila rutinní testování NGS u vzorků pokročilého neskvamózního nemalobuněčného karcinomu plic, karcinomu prostaty, kolorektálního karcinomu, karcinomu žlučovodů a karcinomu vaječníků. V roce 2024 ESMO na tomto základě aktualizovala doporučení a doporučila zahrnout do nich i karcinom prsu a vzácné nádory, jako jsou gastrointestinální stromální nádory, sarkomy, karcinomy štítné žlázy a karcinomy neznámého původu.
Klinické stanovisko ASCO k testování somatického genomu u pacientů s metastatickým nebo pokročilým karcinomem z roku 2022 uvádí, že pokud je u pacientů s metastatickými nebo pokročilými solidními nádory schválena terapie související s biomarkery, doporučuje se u těchto pacientů genetické testování. Například genomické testování by mělo být provedeno u pacientů s metastatickým melanomem za účelem screeningu mutací BRAF V600E, protože pro tuto indikaci jsou schváleny inhibitory RAF a MEK. Genetické testování by mělo být provedeno také v případě, že existuje jasný marker rezistence na lék, který má být pacientovi podán. Například egfrmab je neúčinný u kolorektálního karcinomu s mutací KRAS. Při posuzování vhodnosti pacienta pro genové sekvenování by měl být integrován fyzický stav pacienta, komorbidity a stadium nádoru, protože řada kroků potřebných pro genomové sekvenování, včetně souhlasu pacienta, laboratorního zpracování a analýzy výsledků sekvenování, vyžaduje, aby pacient měl dostatečnou fyzickou kapacitu a očekávanou délku života.
Kromě somatických mutací by některé druhy rakoviny měly být testovány také na zárodečné geny. Testování na zárodečné mutace může ovlivnit rozhodnutí o léčbě rakoviny, jako jsou mutace BRCA1 a BRCA2 u rakoviny prsu, vaječníků, prostaty a slinivky břišní. Zárodečné mutace mohou mít také důsledky pro budoucí screening a prevenci rakoviny u pacientů. Pacienti, kteří jsou potenciálně vhodní pro testování na zárodečné mutace, musí splňovat určité podmínky, které zahrnují faktory, jako je rodinná anamnéza rakoviny, věk při diagnóze a typ rakoviny. Mnoho pacientů (až 50 %) s patogenními mutacemi v zárodečné linii však nesplňuje tradiční kritéria pro testování na zárodečné mutace na základě rodinné anamnézy. Proto, aby se maximalizovala identifikace nositelů mutací, Národní komplexní síť pro boj s rakovinou (NCCN) doporučuje, aby všichni nebo většina pacientů s rakovinou prsu, vaječníků, endometria, slinivky břišní, kolorektálního a konečníku nebo prostaty byli testováni na zárodečné mutace.
Pokud jde o načasování genetického testování, jelikož drtivá většina klinicky významných řídicích mutací je klonální a relativně stabilní v průběhu progrese rakoviny, je rozumné provádět genetické testování u pacientů v době diagnózy pokročilého karcinomu. Pro následné genetické testování, zejména po molekulárně cílené terapii, je testování ctDNA výhodnější než DNA nádorové tkáně, protože krevní DNA může obsahovat DNA ze všech nádorových lézí, což je příznivější pro získání informací o heterogenitě nádoru.
Analýza ctDNA po léčbě může být schopna předpovědět odpověď nádoru na léčbu a identifikovat progresi onemocnění dříve než standardní zobrazovací metody. Protokoly pro použití těchto dat k vedení rozhodnutí o léčbě však nebyly stanoveny a analýza ctDNA se nedoporučuje, s výjimkou klinických studií. ctDNA lze také použít k posouzení malých zbytkových lézí po radikální operaci nádoru. Testování ctDNA po operaci je silným prediktorem následné progrese onemocnění a může pomoci určit, zda bude pacient mít prospěch z adjuvantní chemoterapie, ale stále se nedoporučuje používat ctDNA mimo klinické studie k vedení rozhodnutí o adjuvantní chemoterapii.

Zpracování dat Prvním krokem v sekvenování genomu je extrakce DNA ze vzorků pacientů, příprava knihoven a generování nezpracovaných sekvenčních dat. Zpracovaná data vyžadují další zpracování, včetně filtrování nekvalitních dat, jejich porovnání s referenčním genomem, identifikace různých typů mutací pomocí různých analytických algoritmů, určení vlivu těchto mutací na translaci proteinů a filtrování mutací v zárodečné linii.
Anotace řídicího genu je navržena tak, aby rozlišovala mutace řídicího a pasažérského genu. Řidičské mutace vedou ke ztrátě nebo zvýšení aktivity tumor supresorových genů. Mezi malé varianty, které vedou k inaktivaci tumor supresorových genů, patří nesmyslné mutace, mutace s posunem čtecího rámce a mutace klíčových splicingových míst, stejně jako méně časté delece start kodonů, delece stop kodonů a široká škála mutací inzerce/delece intronů. Kromě toho mohou missense mutace a malé mutace inzerce/delece intronů také vést ke ztrátě aktivity tumor supresorových genů, pokud ovlivňují důležité funkční domény. Mezi strukturní varianty, které vedou ke ztrátě aktivity tumor supresorových genů, patří částečná nebo úplná delece genů a další genomové varianty, které vedou k destrukci čtecího rámce genu. Malé varianty, které vedou ke zvýšené funkci onkogenů, patří missense mutace a občasné inzerce/delece intronů, které cílí na důležité funkční domény proteinů. Ve vzácných případech může zkrácení proteinu nebo mutace splicingových míst vést k aktivaci onkogenů. Mezi strukturní variace, které vedou k aktivaci onkogenů, patří genová fúze, genová delece a genová duplikace.
Klinická interpretace genomové variace hodnotí klinický význam identifikovaných mutací, tj. jejich potenciální diagnostickou, prognostickou nebo terapeutickou hodnotu. Existuje několik systémů hodnocení založených na důkazech, které lze použít k vodítku pro klinickou interpretaci genomové variace.
Databáze precizní onkologické medicíny (OncoKB) v Memorial Sloan-Kettering Cancer Center klasifikuje genové varianty do čtyř úrovní na základě jejich prediktivní hodnoty pro užívání léků: úroveň 1/2, biomarkery schválené FDA nebo klinicky standardní, které predikují odpověď na specifickou indikaci na schválený lék; úroveň 3, biomarkery schválené nebo neschválené FDA, které predikují odpověď na nové cílené léky, které se v klinických studiích osvědčily, a úroveň 4, biomarkery neschválené FDA, které predikují odpověď na nové cílené léky, které v klinických studiích prokázaly přesvědčivé biologické důkazy. Byla přidána pátá podskupina spojená s rezistencí na léčbu.
Pokyny Americké společnosti pro molekulární patologii (AMP) / Americké společnosti pro klinickou onkologii (ASCO) / Vysoké školy amerických patologů (CAP) pro interpretaci somatických variací rozdělují somatické variace do čtyř kategorií: Stupeň I, se silným klinickým významem; Stupeň II, s potenciálním klinickým významem; Stupeň III, klinický význam neznámý; Stupeň IV, u kterého není známo, zda je klinicky významný. Pro rozhodnutí o léčbě jsou cenné pouze varianty stupně I a II.
Škála klinické operability molekulárních cílů (ESCAT) organizace ESMO klasifikuje genové varianty do šesti úrovní: Úroveň I, cíle vhodné pro rutinní použití; Fáze II, cíl, který je stále studován, bude pravděpodobně použit ke screeningu populace pacientů, kteří by mohli mít z cílového léku prospěch, ale k jeho podpoře je zapotřebí více dat. Stupeň III, cílené genové varianty, které prokázaly klinický přínos u jiných druhů rakoviny; Stupeň IV, pouze cílené genové varianty podložené preklinickými důkazy; Stupeň V, existují důkazy podporující klinický význam cílení mutace, ale terapie jedním lékem proti cíli neprodlužuje přežití nebo lze přijmout kombinovanou léčebnou strategii; Stupeň X, nedostatek klinické hodnoty.